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  • 微生物組學

    MICROBIAL GENOMICS
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    真核有參轉錄組

    Eukaryotic transcriptional group

    產品介紹

    真核包括真菌和動植物,對于有參考基因組的真核轉錄組研究,通過計算基因的表達量,揭示其中轉錄活性較高的相關基因及其功能。另外依據參考基因組,可進行諸如基因覆蓋度、測序飽和度等驗證性分析;還可進行變剪切分析以及聯合miRNA數據進行關聯分析等高級分析,能夠全面快速的獲得某一物種特定組織或器官在某一狀態下的幾乎所有轉錄本序列信息。

    產品優勢


    • 轉錄本

      檢測信號是數字信號,幾乎覆蓋所有轉錄本


    • 稀有轉錄本

      在單核苷酸水平對物種的整體轉錄活動進行檢測,能夠發現未知轉錄本和稀有轉錄本


    • 提取樣品

      從RNA樣品的提取、運輸、檢測、建庫、上機測序等每一個環節進行嚴格把控

    實驗流程

    Total RNA
    mRNA片段化
    cDNA合成
    文庫構建
    上級測序

    分析流程

    樣品要求


    • 組織樣品

      動物組織≥2g;植物組織≥4g;菌液≥2ml(密度約107個/ml,OD600約0.7),離心除去培養基??捎肦NA保護劑(菌體/組織體積:RNAlater=1:5)處理或液氮凍存后保存。


    • RNA樣品

      濃度≥50ng/μl,總量≥1μg(單次建庫),OD260/280:1.8-2.2,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,動物28S:18S≥1,植物25S:18S≥1,菌體23S:18S≥1,確保RNA無降解。


    • cDNA樣品

      濃度≥10ng/μl,總量≥2μg(單次建庫),RIN值≥6.5,OD260/280介于1.8~2.2之間

    技術參數

    測試策略 數據量 周期
    HiSeqPE150 6G~12G 65個工作日
    • 真核有參轉錄組測序需要多少數據量?

      答:對真核有參考基因組的轉錄組,采用最低4-6Gb clean data進行后續分析,如果想檢測到低豐度的轉錄本推薦采用8Gb clean data。

    • 轉錄組測序和DGE的關系是什么?

      答:轉錄組和DGE主要的差別在于數據量和分析內容上,轉錄組的數據量較大,除了分析差異基因,還可以進行基因結構分析,而DGE就是數字基因表達譜,它的數據量較小,一般只分析差異基因,不能進行基因結構分析。

    • 真核核糖體RNA去除率一般多高?和原核轉錄組去核糖體RNA的方法一樣嗎?

      答:真核和原核去除核糖體的原理是一致的,現在去除真核生物rRNA的kit主要是Ribozero公司的,針對特異物種。根據長期項目經驗,絕大多數真核生物去除rRNA的效率大于90%。


    轉錄本組裝

    Reads比對到基因組后,將會用Cufflinks進行組裝,考慮到覆蓋度存在gap而導致轉錄本組裝不完整的情況,我們更傾向于基于參考序列的組裝方式(reference annotation based transcripts, BRAT)。Cufflinks會根據參考轉錄本構建出人工reads,來彌補測序中低覆蓋度的影響,這些reads將會與比對上的序列一起用于組裝。最后一步組裝出來的轉錄片段會與參考基因進行比較,與已知轉錄本一致的片段將會被去掉。


    基因表達水平分析

    其中,M=log2(FoldChange),A=log2(CPM),縱坐標表示差異倍數,橫坐標表示平均表達量。該圖反映出整體差異倍數和平均表達量之間的關系,用于對差異基因的權衡,其中紅色的點表示差異顯著的基因,黑色的點代表差異不顯著的基因。


    差異基因表達水平聚類

    差異基因聚類分析用于判斷不同實驗條件下差異基因表達量的聚類模式。通過將表達模式相同或相近的基因聚集成類,從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能;因為這些同類的基因可能具有相似的功能,對所有差異基因進行聚類分析。


    KEGG富集分析

    在生物體內,不同基因間通過相互協調行使其生物學功能?;赑athway顯著性富集分析有助于確定差異基因參與的主要生化代謝途徑和信號轉到途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是有關Pathway的主要公共數據庫(Kanehisa,2008)。Pathway顯著性富集分析以KEGG Pathway為單位,應用超幾何檢驗,找出差異基因相對于所有有注釋的基因顯著富集的pathway。


    橫軸:Rich factor指差異表達的基因中位于該pathway條目的基因數目與所有有注釋基因中位于該pathway條目的基因總數的比值,Rich factor值越大表示富集程度越高;圓點越大此pathway中候選靶基因個數越多,而點的顏色對應于不同的qvalue范圍??v軸:pathway名稱。


    差異基因GO富集分析

    GO功能顯著性富集分析給出與基因組背景相比,在差異基因中顯著富集的GO功能條目,從而給出差異基因與哪些生物學功能顯著相關。該分析首先把差異基因向GO數據庫 (http://www.geneontology.org) 的各個term映射,計算每個term的基因數目,從而得到具有某個GO功能的基因列表及基因數目。然后找出與整個基因組背景相比,在差異基因中顯著富集。采用GOstat進行GO富集分析,此方法可以用于差異基因的篩選和GO term富集分析,以柱狀圖的形式展示富集結果,并用topGO方法對差異上下調基因進行GO的有向無環圖分析。


    每個節點代表一個GO術語,方框代表的是富集程度為TOP5的GO,顏色的深淺代表富集程度,顏色越深就表示富集程度越高,每個節點上展示了該TERM的名稱及富集分析的p-value.,若結果文件夾沒有存在對應的圖則是在該富集程度沒有富集到。

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