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  • 微生物組學

    MICROBIAL GENOMICS
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    真核無參轉錄組

    Eukaryotic non reference transcriptional group

    產品介紹

    真核包括真菌和動植物,對于沒有參考基因組的真核轉錄組研究,通過進行de novo基因組預測,并對預測所得轉錄本進行功能注釋、SNP、SSR標記開發等分析。揭示其中轉錄活性較高的相關基因及其功能。一般而言,轉錄組具有不同的梯度的實驗設計(如不同溫度,不同添加物濃度等等),所以會有多個轉錄組進行比較分析,從而揭示與研究的功能(表象)具有一定聯系的基因(簇)或代謝途徑(機制)。

    產品優勢


    • 無需了解物種的基因信息

      無需了解物種的基因或基因組信息,便可直接對任意物種進行最全面的轉錄組分析


    • 可檢測未知基因

      可檢測未知基因,發現新的轉錄本


    • 提供全方位的售前售后服務

      從實驗方案設計到分析報告解讀,提供全方位的售前售后服務

    實驗流程

    Total RNA
    mRNA片段化
    cDNA合成
    文庫構建
    上級測序

    分析流程

    樣品要求


    • 組織樣品

      動物組織>2g;植物組織>4g;菌體>2ml(密度約106-108 個/ml,對數期或穩定初期,OD600約0.6-0.8),菌液離心除去培養基;血液樣品>2ml。菌體及動物組織可用RNA保護劑(菌體/組織體積:RNAlater=1:5)處理或液氮凍存后保存


    • RNA樣品

      濃度≥50ng/μl,總量≥1μg(單次建庫),OD260/280介于1.8~2.2之間,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,動物28S:18S≥1.0,植物25S:18S≥1.0,菌體23S:18S≥1.0,確保RNA無降解


    • cDNA樣品

      濃度≥10ng/μl,總量≥2μg(單次建庫),RIN值≥6.5,OD260/280介于1.8~2.2之間

    技術參數

    測試策略 數據量 周期
    HiSeqPE150 6G~12G 50個工作日
    • 真核無參轉錄組測序需要多少數據量?

      答:對真核沒有參考基因組的轉錄組測序,需要進行轉錄本的拼接組裝,為了拼接組裝的完整性,推薦最低6-8Gb clean data的轉錄組測序。

    • 如何確定研究物種有無參考基因組?

      答:根據所研究物種的拉丁文名,可在Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html) 、JGI(http://genome.jgi-psf.org/ )及NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有該物種的基因組信息,也可在其他專門介紹某種物種的網站尋找參考基因組。

    • 注釋的unigene的序列如何在NCBI 上blast?

      答:比對NR數據庫時用的方法為Blastx,例如,與odorant receptor相關的基因c31032_g1(基因ID),以此基因ID在unigene.fasta中得到相應基因序列,在NCBI數據庫中進行比對。Blast方法:選擇blastx,在Database選項中選擇Non-redundant protein sequences(nr),即可得到blast結果,有時會出現多個基因,優先選擇E-value小的結果作為候選。


    Unigene定量和差異表達分析

    火山圖每個點代表一個基因,橫坐標表示log2倍的差異倍數,縱坐標表示Qvalue的負對數值,圖中紅色的點代表統計檢驗顯出差異的基因。


    Unigene的功能注釋及富集分析

    功能注釋的具體流程是:首先,將Unigene序列分別比到NR庫, Swissprot庫,KEGG、KOG、Uniprot數據庫 (evalue<1E-5),得到跟給定Unigene序列具有最高序列相似性的蛋白的gi號和accession number,獲得該蛋白的注釋信息。我們對Unigene在各數據庫上的注釋情況進行了統計,并繪制成韋恩圖。


    Unigene的KEGG富集分析

    KEGG是系統分析基因產物在細胞中的代謝途徑以及這些基因產物功能的數據庫。根據與KEGG庫blastx結果,進行KO id的mapping,得到每個Unigene的KO id及Pathway注釋。 我們選擇P-Value≤0.05的Pathway定義為在差異表達基因中顯著富集的Pathway,KEGG參考代謝通路圖是根據已有的知識繪制出概括的、詳盡的具有一般參考意義的代謝圖,根據Pathway富集找到所有的顯著的代謝通路圖。 橫坐標表示Rich factor,是前景與背景的比值,數值越大富集效果越好,縱坐標為KEGG通路名稱;點的顏色對應Pvalue,Pvalue從小到大,對應顏色從紅色變為藍色;該通路富集的基因越多,點越大。


    打開web的鏈接后得到每個通路圖及差異基因的標注,紅色方框表示差異基因

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