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  • 微生物組學

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    GeoChip 功能基因芯片

    產品介紹

    GeoChip 功能基因芯片由國際著名學者,勞倫斯獎(The Ernest Orlando Lawrence Award,2015)獲得者周集中(Joe Jizhong Zhou)教授及其團隊研發,是環境基因組學研究的一個重大突破。 GeoChip是一種基于全球基因組公共數據庫并針對微生物相關的各類功能基因設計特異性的寡核苷酸探針,從而揭示微生物群落功能基因的多樣性的高通量宏基因組檢測工具。最新的GeoChip 5.0版本涵蓋超過570,000種探針,靶向與基礎生物地球化學循環、能量代謝及熱點研究主題密切相關的2400多種功能基因家族中260,000余種編碼基因。該技術作為每年100項最具創新的科學技術發明,榮獲美國R&D雜志2009年頒發的R&D 100獎。

    產品優勢


    • 重復性高

      平行樣品間結果重現性高


    • 檢測類群廣

      涵蓋多個功能類別,包括生物地球化學、能量循環、環境脅迫與抗性、有機污染物的生物降解、抗生素抗性及致病性相關的功能、次級代謝以及病毒相關的功能


    • 宿主基因組的干擾少

      GeoChip根據微生物相關的各類功能基因獨立設計特異性的探針,極大地降低了特殊樣品中動植物宿主基因組對微生物群落功能檢測的影響


    • 數據可讀性強

      與基于測序的宏基因組數據相比,GeoChip數據簡單易懂,可直接用于各類統計分析,有助于結果的解讀和比較

    實驗流程

    樣品采集
    核酸(DNA/RNA)提取
    核酸檢測
    熒光標記
    芯片雜交
    芯片掃描與成像

    分析流程

    樣品要求


    • DNA樣品

      濃度≥50ng/μl,總量≥3μg,OD260/280:1.8-2.0,OD260/230≥1.5,無明顯的DNA降解,無 RNA、蛋白質等雜質污染。


    • RNA樣品

      濃度≥65ng/μl,總量≥3.5μg,OD260/280:1.8-2.0,23S/16S≥1.0,RIN≥6.0;無基因組污染、無蛋白和雜質污染、無顏色異常。


    • 樣品運輸

      樣品保存期間切忌反復凍融,送樣時請使用冰袋或干冰運輸。請同時附上QC數據,包括電泳膠圖、分光光度或Nanodrop檢測數據。

    技術參數

    測試策略 數據量 周期
    DNA或cDNA 60K/180K 55個工作日
    RNA 60K/180K 65個工作日
    • GeoChip與常規的核酸檢測方法相比有什么優勢?

      答:常規的核酸檢測方法包括基因克隆文庫、變性梯度凝膠電泳DGGE、溫度梯度凝膠電泳TGGE、末端限制性片段長度多態性(T-RFLP)、定量PCR和原位雜交等,盡管這些技術有一定價值,但它們的的缺點是信息量太小,不能充分反映復雜的環境微生物多樣性和分布?;蚩寺∥膸鞓嫿ê蜋z測的工作量大,且自然界中99%的微生物在實驗室都沒有辦法純化培養,從培養基上挑取克隆菌株,搖菌轉化測序,效率低下。DGGE法曾經廣泛應用于檢測微生物群落結構或功能的多態性,但是需要標準菌株,且受到凝膠電泳特性的局限,無法檢測到稀有菌群的種類,因此其重復性和分辨率都不甚理想。GeoChip涵蓋了多個功能類別,同時,這些相關功能基因涉及了細菌、古菌、真菌、原生生物、病毒等多種生物類群,較常規的研究方法更加簡便、經濟、快捷,能在短時間內獲得更多更準確的信息。

    • GeoChip與擴增子測序技術和PhyloChip相比有什么優勢?

      答擴增子測序以及PhyloChip都能揭示群落的系統發育信息,適用于16S rRNA基因的檢測,但是這些技術都依賴于PCR的擴增以及保守性引物。而擴增子測序也適用于部分功能基因的檢測,然而大部分的功能基因仍不能設計出足夠保守的PCR引物,也就是說除了GeoChip以外目前只有極少數的功能基因能通過測序的辦法檢測。不僅如此,這些基于傳統PCR擴增的測序技術由于擴增偏好性的客觀因素仍很難實現準確定量,且這些技術對系統的隨機誤差極其敏感。盡管通過獲得系統中絕大部分物種的序列信息能在很大程度上消除這些誤差,但是依據目前的測序技術需要付出巨大的成本。相比之下,基于芯片的雜交技術對隨機誤差并不敏感,而只需關注芯片中明確的基因,且GeoChip技術對物種的分辨率也高于基于16S rRNA基因的擴增子測序。但是,基于測序的檢測技術能有助于我們發現新的基因和功能信息,因此,綜合利用多種高通量的檢測手段能更全面地揭示微生物群落的系統發育以及功能結構,最終更好地回答我們的科學問題和假設。美格基因與很多公司和機構一樣提供擴增子測序服務。此技術需要較為少量的環境樣品DNA,通過基于保守引物的PCR擴增來或者群落的系統發育基因(如16S rRNA基因)或功能基因(amoA基因)。擴增子測序一般可以對多個樣品進行混樣后進行。

    • GeoChip和宏基因組應如何選擇?

      答:GeoChip是根據微生物相關的各類功能基因獨立設計特異性的探針,能極大地降低特殊樣品中動植物宿主基因組對微生物群落功能檢測的影響,且具有平行樣品間結果高重現性高和高靈敏度的等特點,適用于探索已知基因及物種的未知規律。宏基因組技術直接針對微生物群落總的DNA進行測序,其數據量巨大。盡管宏基因組測序可以發現新的基因,然而我們能獲得序列片段和信息更多只能來源于高豐度的物種或多拷貝的基因。同時,對如此大量的數據進行深入分析是個十分巨大的挑戰。GeoChip和宏基因組都關注環境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息,均可用于挖掘環境樣本功能層面的信息。

    • 芯片中Unique和Group 探針有什么區別?

      答:Unique探針只會靶向唯一基因的探針,Group探針會靶向一組有共同保守序列的基因。

    • GeoChip是否需要考慮功能基因片段大小的問題?

      答:無論多長的功能基因都含有保守區域,因此不用考慮功能基因片段大小的問題。

    • 樣品數量及重復數量要求如何?

      答:通常要求至少2個組,每組至少3個重復,建議樣品總數不低于12個,且具備一定的實驗設計基礎。一方面為了避免假陽性,一方面重復數不足時多項統計學分析將沒有意義。

    • 為什么前面提到雜交實驗只需要0.2至1微克的DNA,而送樣要求為3微克以上?

      答:首先需要明確,能做和做得效果好是兩回事,為保證實驗檢測效果,低于1微克的樣品都需要擴增,同時實驗也有失敗的情況,所以需要準備至少兩次實驗所需的DNA樣品。

    • GeoChip中平常說的60K、180K是指什么,有什么區別?

      答:60K和180K 均為GeoChip5.0中探針數,分別指6萬和18萬探針,60K包含了GeoChip5.0中基礎物質循環(碳、氮、硫、磷)和有機污染降解相關功能基因的絕大部分探針及部分其他常見功能基因的探針,180K中增加了電子轉運、應激響應及病毒相關的探針,并大幅度提高了重金屬抗性、致病性、次生代謝及抗生素抗性等各類基因的探針數量。

    • GeoChip、HuMiChip、PathoChip和StressChip有什么聯系和區別?

      答:HuMiChip是針對人類相關微生物重新設計的芯片,涵蓋的探針與GeoChip沒有重復,PathoChip病原芯片和StressChip抗性芯片有部分探針來自GeoChip。

    • GeoChip的數據分析難度如何?

      答:GeoChip數據具有非常清晰明了的基因注釋信息,并涵蓋多個基因類別的信息,方便進行功能基因的統計和比較分析。與基于測序的宏基因組數據相比,GeoChip數據簡單易懂,可直接用于各類統計分析,因此有助于結果的解讀和比較。


    物種相對豐度分布圖

    根據探針對應的物種信息,選取每個樣品在中相對豐度大于等于1%的物種,生成物種相對豐度分布圖,以便直觀查優勢微生物類群在不同樣品間的相對豐度變化情況。


    物種相對豐度熱圖

    對所有檢測到的物種相對豐度進行計算,選取在各個樣品中相對豐度大于等于1%的物種,進行物種和樣品兩個層面的聚類。對樣品進行聚類(依據是不同樣品中檢測到的物種的熒光強度相近,即所含菌屬數量越相近,樣品間相似性越高),對聚類后各樣品中不同菌屬所對應的熒光強度相對豐度作heatmap圖,能夠反映出各樣品菌落結構的相似性和差異性。


    樣品共有特有基因數目統計

    基于每個樣品檢測到的陽性基因,統計樣品間共有特有基因數目。


    功能類群相對代謝潛能熱圖

    熱圖是以顏色梯度來代表數據矩陣中數值的大小并能根據樣品功能基因代謝潛能信息或樣品間功能組成相似性進行聚類的一種圖形展示方式,它可以直觀地將數據值的大小以定義的顏色深淺表示出來。通過顏色的梯度及相似程度來反映數據的相似性和差異性。如對樣品所含功能基因相對代謝潛能進行聚類分析(依據不同樣品中各功能基因的信號強度越相近,即所含功能基因的代謝潛能越相近,樣品間相似性越高),能夠反映出各樣品功能基因結構的相似性和差異性。分析如下圖所示,縱向聚類表示樣品聚類樹;橫向為功能基因聚類樹。聚類采用樣品功能基因類群的相對代謝強度進行。


    主成分分析(PCA,Principal Component Analysis)

    主成分分析是一種應用方差分解方法,對多維數據進行降維,從而提取出數據中最主要的元素和結構。應用PCA分析,能夠提取出最大程度反映樣品間差異的兩個坐標軸,即主成分1(PC1)和主成分2(PC2),并以百分數的形式體現主成分主要影響程度,從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上,進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。如果樣品的群落組成越相似,則它們在PCA圖中的距離越接近。


    組間功能基因代謝潛能對比(雙尾配對t檢驗)

    選取關鍵的或關注的功能類群進行組間差異顯著性檢驗,尋找在樣品間豐度具有顯著差異的基因。橫軸表示各類碳降解基因??v軸表示標準化信號強度,代表基因相對豐度差異。顯著性檢驗采用雙尾配對t檢驗,星號標示出在增溫區與對照區豐度差異顯著的基因(**p<0.01, *p<0.05)。


    功能基因構成與環境因素的典范對應分析(CCA)及方差分解分析(VPA)

    用于展現與功能基因構成有密切聯系的主要環境因素及其重要程度。圖a橫縱軸為解釋度最高的兩個維度,坐標名稱中的百分數代表解釋度。環境因素包括土壤濕度(Soil M)、土壤溫度(Soil T)、總初級生產量(GPP)。圖b邊角圓形中百分比代表某一個(或一類)環境因素排除其他因素影響后對功能基因構成差異的解釋度,連線上百分比代表某兩個(或兩類)環境因素的交互作用排除其他影響后的解釋度,中心圓形代表三類環境因素的共同交互作用排除其他影響后的解釋度,而下部方形代表三類環境因素無法解釋的比例。

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