• <strong id="uqi0y"></strong>
  • 微生物組學

    MICROBIAL GENOMICS
    網站首頁 > 科研服務 > 微生物組學

    16S、18S、ITS 擴增子測序

    產品介紹

    擴增子測序是指利用合適的通用引物擴增環境中微生物的16S rDNA/18S rDNA /ITS高變區或功能基因,通過高通量測序技術檢測PCR產物的序列變異和豐度信息,分析該環境下的微生物群落的多樣性和分布規律,以揭示環境樣品中眾多的微生物種類及它們之間的相對豐度和進化關系。

    產品優勢


    • 提取經驗豐富

      土壤(農田土壤、森林土壤等);水體(海水、湖泊水、水庫水等);活性污泥或底泥(海洋沉積物、AMD底泥、熱泉底泥等)等各種環境,數萬例樣品的提取經驗,建立了一系列針對特定環境的手工提取DNA或試劑盒提取DNA的標準方法。


    • 客觀真實

      采用PCR-free建庫方式,避免PCR過程的堿基錯配,真實還原樣本內物種組成信息。


    • 平臺最優

      采用最主流的Illumina HiSeq/Miseq最長測序平臺,可以滿足16S 1~2個高變區的測序分析,成本更低、通量更大、測序質量和拼接效率更高。 應用領域

    實驗流程

    樣品準備
    DNA提取
    PCR擴增
    文庫制備及庫檢
    上機測序

    分析流程

    樣品要求


    • 環境樣品

      土壤、淤泥、沉積物≥3 g;糞便≥500 mg;組織樣本≥1 g;水體送樣為過濾后的濾膜(最適濾膜直徑3-4cm);拭子樣本≥2個。


    • DNA樣品

      濃度≥5 ng/μl;總量≥150 ng;DNA 有明顯主帶,無降解、無 RNA、蛋白質等雜質污染。


    • PCR產物

      濃度≥20ng/μl,總量≥400ng,片段大?。?60bp,條帶單一,無降解,無引物二聚體。

    技術參數

    測試策略 數據量 周期
    HiSeq2500/Miseq,PE250/PE300 3w/5w/10w 條Tags 35個工作日
    • 擴增子測序能滿足的測序長度是多少?

      答:Miseq PE300平臺測序長度為600bp,但其測序質量較差,質控需要過濾掉超過100bp質量較差的序列;Hiseq2500 PE250平臺測序質量較好,但測序總長度為500bp,去掉12bp的barcode和部分質量較差的序列之后只剩460bp左右。所以保守起見,擴增子片段長度不能超過460bp,否則雙端測序結果將無法進行拼接,在引物選擇時應引起注意。

    • DGGE技術與高通量測序技術在環境微生物群落多樣性研究中有什么區別?

      答:DGGE等分子指紋圖譜技術,在其實驗結果中往往只含有數十條條帶,只能反映出樣品中的優勢種群,需要標準菌株,且受到凝膠電泳特性的局限,無法檢測到稀有菌群的種類,因此其重復性和分辨率都不甚理想。而高通量測序技術能同時對樣品中的優勢種群及微量菌進行檢測,獲得樣品中的微生物群落組成,并將其含量進行數字化。

    • 擴增子測序和宏基因組測序的區別?

      答:擴增子主要分為16S、18S、ITS等測序,關注環境樣本中的物種組成,該技術物美價廉,實用性高。宏基因組關注環境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息,該技術深入挖掘環境樣本功能層面的信息。

    • 是否需要生物學重復,多少個合適?

      答:為了數據質量、結果產出及順利投稿,必須注意生物學重復問題??紤]到個體差異,后期組間統計學分析以及偏離樣本,自然環境至少3個生物學重復,推薦5個;若是人類的腸道、糞便等樣品,由于個體特異性高,建議10個以上的重復。

    • 若關注環境中的真核微生物多樣性,18S測序和ITS測序哪個更好?

      答:ITS測序主要是針對真菌多樣性的研究,注釋準確度高;18S測序針對的是真核微生物,注釋到的范圍廣,但是就真菌來說精確度相對較低;可根據研究目的合理選擇測序方案。

    • 擴增子測序和宏基因組測序的對象主要是環境微生物,請問針對此類樣本推薦的DNA提取方法是什么?

      答:針對環境樣本推薦老師采用常規的CTAB法或SDS法;其中人和動物組織樣本使用SDS方法,其他樣本采用CTAB法。另外,針對一些較難提取的樣本或您希望提高樣品DNA的提取效果,推薦使用Mobio公司專門的環境樣本DNA提取試劑盒。

    • 分類學注釋中Unclassified、Unidentified及Others分別表示什么意思?f_Legionellaceae和f_Legionellaceae,g_s_有何區別?

      答:Unidentified:分類學比對時在設定的置信閾值以下或沒有分類信息的reads;Unclassified:在數據庫中沒有找到對應于該序列的分類信息;Others:注釋到多個數據庫的reads;此處應注意,物種相對豐度分布圖中的Others則包含上述三種注釋結果及相對豐度小于1%的物種。g_和s_是數據庫中在屬和種水平有對應的序列信息,但是沒有注釋信息,f_Legionellaceae是數據庫中在屬和種水平沒有對應的序列信息。

    • 樣品OTUs Venn分析圖中每個樣品的OTU數為什么和各樣品所含OTU數及序列數統計表格中的OTU數不對應?

      答:不同的樣品的序列數不同,為了排除因樣本間測序數目不同而引入的誤差,所以以序列數最低的樣品為標準,對不同樣品進行重抽樣,使各樣品的序列數在同一水平下進行樣品間的比較分析。

    • 物種相對豐度熱圖分析中為什么數據結果的表格中沒有負值,而圖中的圖例有負數?

      答:直接用相對豐度值進行熱圖的繪制,常常會由于聚類結果中出現相對豐度值分布不均勻,導致大部分豐度較低的物種呈現相同或相近的顏色,不利于樣品及物種間的比較分析,因此我們在繪制之前對數值進行了標準化,即對每一個豐度排在前30的物種單獨進行z-Score并取自然對數后繪制熱圖。

    • Alpha多樣性的結果怎么看,各指數之間是否可以進行比較?

      答:Alpha多樣性即樣品內部的生物多樣性,跟其他樣品無關,但不同的樣品之間亦可以進行數值上的比較(在序列數目一致的前提下)。Alpha多樣性根據OTU table和系統發育樹進行計算,通常計算的參數包括 observed species指數(OTUs)、chao1指數、shannon指數、simpson指數以及PD whole tree,其中observed species指數和chao1指數反映樣品中群落的豐富度,即簡單指群落中物種的數量(OTU數目),而不考慮群落中每個物種的豐度情況,數值越大,說明樣品中物種越豐富;shannon指數、simpson指數以及PD whole tree反映群落的多樣性,受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響,shannon、simpson指數以及PD whole tree的值越大,說明樣品群落多樣性越高。


    物種相對豐度分布圖

    根據物種注釋結果,選取每個樣品在各分類水平(Phylum、Class、Order、Family、Genus)上相對豐度大于等于1%的物種,生成物種相對豐度分布圖,以便直觀查優勢微生物類群在不同樣品間的相對豐度變化情況。


    物種相對豐度熱圖

    對各層級物種相對豐度進行排序,選取排序在前30的物種,進行物種和樣品兩個層面的聚類。對樣品進行聚類(依據是不同樣品中各 OTU 的序列數越相近,即所含菌屬數量越相近,樣品間相似性越高),對聚類后各樣品中不同 OTU(不同菌屬)所含序列的豐度作heatmap圖,能夠反映出在菌屬水平上各樣品菌落結構的相似性和差異性。


    物種進化樹分析

    選取總體相對豐度排在前50且有屬分類信息的OTU的代表性序列,構建系統發育樹。每個分支末尾的名稱由屬名和對應的OTU編號組成,若屬名相同則使用同種顏色進行標記。該圖可以看出相對豐度較高的屬主要是哪些,此外,也包含了物種之間的進化分類關系,即不同的分支結構。


    主成分分析(PCA,Principal Component Analysis)

    主成分分析是一種應用方差分解方法,對多維數據進行降維,從而提取出數據中最主要的元素和結構。應用PCA分析,能夠提取出最大程度反映樣品間差異的兩個坐標軸,即主成分1(PC1)和主成分2(PC2),并以百分數的形式體現主成分主要影響程度,從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上,進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。如果樣品的群落組成越相似,則它們在PCA圖中的距離越接近。


    NMDS分析

    NMDS(Nonmetric Multidimensional Scaling)非度量多維尺度法,是一種將多維空間的研究對象(樣本或變量)簡化到低維空間進行定位、分析和歸類,同時又保留對象間原始關系的數據分析方法。適用于無法獲得研究對象間精確的相似性或相異性數據,僅能得到他們之間等級關系數據的情形。其特點是根據樣品中包含的物種信息,以點的形式反映在多維空間上,而對不同樣品間的差異程度,則是通過點與點間的距離體現的,最終獲得樣品的空間定位點圖。


    LEfSE分析

    LEfSe分析即LDA Effect Size分析,可以實現多個分組之間的比較,同時也可進行分組內部亞組之間的比較分析從而找到組間在豐度上有顯著差異的物種(即biomaker)。


    1.1.LDA值

    該圖表示在大于設定的LDA值(LDA>= 2)的條件下不同組中豐度有顯著差異的物種,柱狀圖的長度代表顯著差異物種的影響大小。


    2.進化分支

    該圖由內至外輻射的圓圈代表了由門至屬(或種)的分類級別。紅色區域和綠色區域表示不同分組,在不同分類級別上的每一個小圓圈代表該水平下的一個分類,小圓圈直徑大小與相對豐度大小呈正比。其中無顯著差異的物種以黃色進行標記,差異物種以組的顏色進行著色。某一顏色(如紅色)節點表示在紅色組別中起到重要作用的微生物類群。圓圈中的物種名稱以字母數字等做標記,并在右側圖例中對應展示。


    3.顯著差異物種在不同組中的豐度比較

    將biomaker豐度最高的樣本的豐度設定為1,其他樣品中該biomarker 的豐度為相對于豐度最高樣品的相對值。


    RDA/CCA分析

    此分析是主要用來反映菌群與環境因子之間關系。分析可以檢測環境因子、樣品、菌群三者之間的關系或者兩兩之間的關系。圖中箭頭代表不同的環境因子,射線越長表示該環境因子影響越大。環境因子之間的夾角為銳角時表示兩個環境因子之間呈正相關關系,鈍角時呈負相關關系。不同的圓點表示不同樣品,三角形表示相對豐度大于1%的物種。

    真实处破视频在线观看视频