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  • 微生物組學

    MICROBIAL GENOMICS
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    宏基因組

    Metagenomics

    產品介紹

    宏基因組(Metagenomic),又稱為微生物環境基因組,或元基因組,是指環境樣品中所有微生物基因組的總和。而宏基因組學研究是以特定環境樣品中的微生物群體為研究對象,采用新一代高通量測序技術,對微生物多樣性、種群結構、進化關系、功能潛力、相互協作關系以及與環境之間的關系進行探索和研究。宏基因組測序不受微生物分離培養的限制,為微生物群落研究提供一種有效手段。

    產品優勢


    • 分析經驗豐富

      完成過千例樣本的數據分析,獨有的拼接策略以及分析方法,超高深度數據集分析經驗,國際頂級期刊發表論文數十篇。


    • 測序平臺先進

      采用最主流的Illumina HiSeq測序平臺。


    • 成功率高

      國內最早一批開展宏基因組研究的實驗室,針對不同生境下的環境樣品,建立了一套高標準而又客觀準確的DNA提取標準方法,成功率非常高。

    實驗流程

    樣品采集
    DNA提取
    DNA檢測
    文庫制備及庫檢
    上機測序

    分析流程

    樣品要求


    • 環境樣品

      土壤、淤泥、沉積物≥5 g;糞便≥2 g;組織樣本≥1 g;水體送樣為過濾后的濾膜(最適濾膜直徑3-4 cm);拭子樣本≥2個。


    • DNA樣品

      濃度≥50ng/μl、總量≥2μg, OD260/280:1.8~2.0,主帶明顯,無RNA、蛋白質污染。


    • 樣品運輸

      野外采集的樣品需要低溫冷藏運輸以避免樣品中微生物降解影響樣品后續的提取及分析。

    技術參數

    測試策略 數據量 周期
    HiSeqPE150/PE250 5G/10G 35個工作日
    • 擴增子測序與宏基因組測序的區別?

      答:擴增子測序是針對微生物核糖體小亞基的特定高變區或功能基因區域進行PCR擴增,反映物種的進化關系及群落多樣性。該技術物美價廉,實用性高。宏基因組測序測定整個環境中所有微生物的基因組。在數據分析上又可以分為基因集分析和基因組組裝?;蚣治隹梢赃M行功能分析GO pathway,關注環境樣本中的物種組成、功能組成及代謝通路等信息;基因組組裝可以獲得新的,甚至是不可純培養的微生物基因組序列。

    • 宏基因組測序對樣品的生物學重復有什么要求?如何避免重復性較差的問題出現?

      答:土壤、水體等生態環境樣本建議5個或5個以上的生物學重復;取樣時每個樣品均需多點取樣后混勻,降低單個樣本特異性。人和動物樣本因個體特異性較大,建議10個以上生物學重復;腸道、瘤胃或糞便樣本因含有較多厭氧菌,要快速取樣、迅速低溫保存,針對較難富集微生物的樣品,如各種物體表面,可采用緩沖液洗脫或棉簽擦拭等方法。樣品取好后避免長時間放置,需盡快進行DNA提取,送樣測序。

    • 對于宏基因組項目,怎么排除宿主污染?

      答:取樣時,盡量不要取靠近組織的部位;提取的時候采用相應的試劑盒;若有參考基因組,可通過比對分析去除宿主基因組污染。

    • 宏基因組Miseq平臺和Hiseq 2000平臺上每個樣品分別推薦多少G數據量比較合適,這兩個平臺做宏基因組de novo測序,各自優勢在哪里?

      答:如果宏基因組de novo測序項目使用較多的平臺是Illumina HiSeq 2000(2*100bp),一般單個樣本的測序數據量為8G左右。相比Illumina Miseq,HiSeq 2000測序質量更好,數據更準確可靠,因此如果需要對宏基因組de novo進行拼接,Illumina HiSeq 2000更合適。

    • 為什么進行混合組裝?

      答:首先,根據單樣品多k-mer進行組裝,選取最適Scaffolds,將質控后的Clean data比對至各樣品Scaftigs,獲取各樣品未被利用的PE reads混合后組裝。這樣既充分利用數據,又能挖掘低豐度物種信息。

    • KEGG 能注釋哪些基因?

      答:對所有我們拼接出的基因進行注釋,默認提供C、N、P、S這四個循環的KEGG通路圖,也可以指定自己關注的部分。


    COG注釋

    COG(Clusters of Orthologous Group of proteins)是對基因產物進行直系同源分類的數據庫,每個COG蛋白都被假定來自祖先蛋白。將預測的基因與COG數據庫進行比對,預測其可能的功能并對其做功能分類統計,從宏觀上認識物種的基因功能分布特征。


    代謝通路分析

    通過KEGG基因功能注釋,分析各樣品中與關鍵功能相關的代謝通路中基因的分布情況,及其豐度情況,比較不同分組間關鍵代謝通路的差異。從功能基因及代謝通路的層面來說明對照樣品的關鍵物質代謝路線及含量差異的原因。


    功能豐度聚類

    根據所有樣品在各個數據中的功能注釋及分度信息,對各樣品中的豐度信息繪制熱圖(KEGG選取第二層進行展示,COG選取第一層進行展示),并從功能信息和樣品間差異兩個層面進行聚類,便于結果展示和信息發現,從而找出研究樣品中聚集較多的功能或樣品。 圖中從上至下依次為KEGG、COG的結果展示,橫向為樣品信息,縱向為功能注釋信息。右方的聚類樹為樣品聚類樹,中間熱圖對應的值為每一列功能相對豐度。


    物種組成聚類

    基于各樣品物種分類的結果及其相對豐度,在phylum以及genus水平上分別對各樣品宏基因組進行聚類分析。圖中橫向為物種注釋信息,縱向為樣品信息。上方的聚類樹為樣品聚類樹,中間熱圖對應的值為每一行物種相對豐度,黑色表示相對豐度高,紅色表示中等相對豐度,灰色表示相對豐度低。


    物種PCA分析

    宏基因組樣品基于物種分類的PCA圖。


    功能PCA分析

    宏基因組樣品基于COG功能分類的PCA圖 主成分分析是一種應用方差分解方法,對多維數據進行降維,從而提取出數據中最主要的元素和結構。應用PCA分析,能夠提取出最大程度反映樣品間差異的兩個坐標軸,即主成分1(PC1)和主成分2(PC2),并以百分數的形式體現主成分主要影響程度,從而將多維數據的差異反映在二維坐標圖上,進而揭示復雜數據背景下的簡單規律。如果樣品的群落或功能組成越相似,則它們在PCA圖中的距離越接近。

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